뒤영벌의 인공수정장치는 여왕벌 고정대, 자리잡기용관, 이송용관, 고정관, 조정핸들, 머리받침대, 탐침기, 고정훅, 벌림훅, 주사기 및 선반대, 조정핸들 등으로 구성되어 있다. 또한 이 개발된 인공수정기를 이용하여 여왕뒤영벌을 인공수정을 시키는 단계는 여왕벌을 고정관 등에 고정시키는 단계, 마취단계, 여왕벌의 생식기 손상을 줄이는 탐침단계, 두개의 훅과 조정핸들 등을 이용한 인공수정 준비단계, 정자가 주입된 주사기를 여왕벌 생식기에 주입하는 인공수정단계로 이루어진다.

1. 인공수정기술에 필요한 준비물

  인공수정기, 주사기, 현미경, 멸균소독용기, 이산화탄소, 생리식염수 또는 완충액, Insect ringer 용액, 알코올, 우화 6일 이상 된 여왕벌(그림 19, 20 및 23) 및 6-20일된 수벌(그림 19, 20 및 22) 등을 준비한다(그림 23).

2. 여왕벌 및 수벌 사육법

1) 사육 용기 및 먹이

  뒤영벌 여왕벌을 사육하기 위한 용기는 산란용, 증식용 및 봉군 숙성용 등 3 단계의 종이상자를 이용한다. 플라스틱상자를 이용해서 사육할 수도 있다. 산란용 상자(10.5× 14.5× 10㎝)는 월동한 여왕벌을 실내에 정착시켜 산란을 유도하기 위한 것으로 산란을 쉽게 하기 위하여 직경 5㎝의 페트리디쉬 넣어 그 안에 화분단자를 넣어 준다. 월동한 여왕벌이 산란하여 첫배의 일벌이 출현하면 봉군형성용 상자(21× 21× 15㎝)로 옮겨서 사육을 한다. 일단 봉군형성용 상자에서 일벌이 50마리 정도 출현하면 다시 봉군 숙성용 종이상자(24× 27× 18㎝)로 옮겨서 사육을 행한다. 증식용 및 숙성용 상자의 구조는 산란용 상자와 동일하게 만들어 사용한다(그림 24). 먹이는 40%의 설탕물과 화분단자를 만들어 공급한다. 화분단자는 신선한 생화분을 40%의 설탕물로 혼합하여 소세지 모양으로 만들어서 냉동실에 넣어둔 다음 필요할 때마다 꺼내어 적당한 크기로 잘라서 사용한다(그림 25).

2) 사육방법

(가) 사육조건

월동시킨 여왕벌을 온도 27± 1℃, 습도 65%± 5 R.H. 전암으로 사육을 행한다. 먹이를 줄 경우 등 관리 시에는 적색형광등을 사용한다.

(나) 실내 사육방법

산란용 종이상자에 산란촉진자와 함께 넣은 월동여왕벌에 신선한 화분과 설탕물을 공급한다. 먹이는 일주일에 2～3회 정도 갈아주며 화분단자를 가능한 신선한 양질의 것으로 충분한 양을 준다. 이와 같은 조건 하에서 야외에서 채집한 창설여왕벌의 경우에는 평균 7일 이내, 실내에서 인공계대 사육한 월동여왕벌의 경우 20일 이내에 첫 산란을 한다. 산란한 첫 육아방의 크기는 단경 7.15 ± 0.88 ㎜, 장경 7.79 ± 1.11 ㎜, 높이 3.33 ± 0.22 ㎜이고, 난괴 당 알의 수는 평균 9개로 3개에서 17개까지의 알이 들어 있었다. 알은 유백색의 바나나모양으로 난괴 속에 수평으로 가지런히 산란한 것이 특징이었으며, 알기간은 산란 후 3～4일이었다. 알의 크기는 단경 1.22 ± 0.09 ㎜, 장경 3.51 ± 0.21 ㎜, 무게는 2.70 ± 0.30 ㎎이었다(그림 26). 첫 산란으로부터 약 25일이 되면 첫 일벌이 출현하며 일벌이 5마리 이상 나오면 중간크기 상자인 증식용 상자로 옮겨서 사육을 한다. 이 시기부터는 개체수가 빨리 증가하기 때문에 사육 온도와 습도관리를 잘해 주여야 한다. 특히 온도가 너무 상승하면 여왕벌은 산란활동을 정지하기 때문에 온도의 상승을 철저히 관리해야 한다. 또한 신선한 먹이를 충분히 공급하여 산란활동에 방해하는 일이 없도록 한다. 일단 봉군형성용 상자에서 일벌이 50마리 정도 출현하면 다시 봉군 숙성용 종이상자(24× 27× 18㎝)로 옮겨서 사육을 행한다. 첫산란부터 일벌이 50마리 될 때까지의 평균일수는 약 50일이다(그림 27). 뒤영벌의 봉군의 크기를 살펴보면 봉군당 평균 일벌수는 200마리 이상, 수벌수 700 마리, 새로 출현한 여왕벌수는 평균 100마리 이상으로서 평균 한 마리의 여왕벌은 대략 1,000개의 알을 산란 후 결국 자신의 봉군은 쇠퇴한다(그림 28). 새로 출현한 여왕벌들은 교미 후 월동시켜서 사육한다.

(라) 신여왕벌 및 수벌의 보관 관리

일반적으로 뒤영벌을 실내 사육했을 경우, 일벌은 18-22일, 수벌은 60-74일, 여왕벌은 61-80일 사이에 출현한다(Yoon et al., 1999b). 따라서 여왕벌보다 2-3일 빨리 나오는 수벌의 경우, 사육용 봉군상자에서 수벌을 빼내어 사육온도보다 2-3℃ 낮은 25℃에서 성적으로 성숙하여(적어도 우화 6일이상) 교미할 수 있을 때 까지 보관한다. 여왕벌도 수벌과 동일한 방법으로 주기적으로 봉군상자에서 빼내어 25℃에서 5-6일간 보관 후 교미에 사용한다.

(마) 교미

뒤영벌의 교미는 교미용 상자(55× 65× 40㎝)내에 우화 후 5일째의 신여왕벌과 적정수의 수벌을 넣어 행한다. 교미상자 안에는 화분단자와 설탕물을 공급하였고 상자바닥의 뒷부분에는 여왕벌이 숨을 수 있는 공간을 주기 위하여 부엽토를 가지고 둔덕을 만들어 준다. 1주일간의 교미시킨 후 여왕벌을 수거하여 휴면 처리한다. 여왕호박벌의 교미는 수벌이 처녀여왕벌의 복부 등쪽에 앉은 후 다리를 이용 여왕벌의 흉부와 복부를 잡고 교미기를 삽입하여 이루어진다. 여왕벌의 교미시간은 평균 20-30분 정도이다(그림 29).

3. 뒤영벌의 인공수정 단계

  인공수정전에 모든 사용도구 및 기구들은 철저하게 알코올 등으로 소독을 한 후 사용한다. 특히 주사기는 멸균한 후에 완충액 등으로 세척한다. 뒤영벌 인공수정을 위해 수정장치는 테이블중앙부 전면에 여왕벌 고정대를 설치하고, 위의 고정대에 머리받침대가 삽입된 고정관을 고정대에 고정한 후 탄산가스통에 연결된 호스와 연결한다. 테이블 중앙부의 좌, 우측에 각각 받침대를 설치하고, 왼쪽 받침대에는 고정훅을(그림 24), 오른쪽 받침대에는 벌림훅을(그림 25) 설치한다.여왕뒤영벌은 인공수정 시 배설물이 흘러나오는 것을 방지하기 위해서 몇 분동안 비행시킨 후 사용한다. 비행된 성숙한 여왕벌을 자리잡기용관에 수용한다(그림 26). 자리잡기용관에 수용된 여왕벌은 스스로 머리부분을 출구쪽으로 방향을 전환한다. 자리잡기용관의 출구 쪽에 이송관을 밀착하여 여왕벌을 이송용관으로 이동시킨다(그림 27). 이송용관으로 이동한 여왕벌은 다시 고정관으로 이동시키는데 직경이 작은 쪽의 출구에 여왕벌의 생식기 부분이 노출될 수 있도록 하고(그림 28), 그 반대쪽은 여왕벌의 더듬이 등 머리부분의 손상을 억제하고 마취제인 탄산가스 주입이 용이하도록 머리받침대를 삽입한다(그림 29 및 30). 여왕벌의 배면이 위쪽으로 향하게 고정시킨 후 완충액 등으로 여왕벌의 생식기 주위를 소독한다. 여왕벌의 복부에 은폐된 생식기를 탐침기로 벌리고(그림 31) 고정훅과 벌림훅을 사용하여 수정시키기에 알맞은 상태로 생식기를 고정시킨다(그림 32). 정자채취 전에 주사기는 Insect ringer용액 등을 기포 없이 채운 다음 정액을 주입하기 전에 약 4㎕공간을 둔 다음, 이미 보고한 방법으로(Yoon et al., 2006) 정자를 채취한다. 조정핸들로 정자가 들어있는 주사기를 여왕벌의 생식기와 일치시킨 다음 수정낭관 입구 가까이에 있는 교미낭속으로 주입한다(그림 33). 주사기를 교미기에 주입하기 전에 오렌지 또는 노란색의 얇은 질 막을 걷어낸 후 삽입하며, 삽입 시 여왕벌의 생식기 부분이 손상되지 않도록 주의한다. 정자 주입동안 여왕벌을 편안하게 해서 주사기를 빼내었을 경우, 정자가 흘러나오거나 다시 유입되지 않도록 한다. 주사기에 소량의 정자를 남겨 둔 후 슬라이드에 일부 떨어뜨린 후 현미경하에서 정자의 생존 및 활동성 유무를 관찰한다. 자연적으로 교미한 뒤영벌 여왕벌의 경우, 정자가 90분 이내에 여왕벌의 수정낭속으로 이동한다고 보고하였다 (Duvosin et al., 1999). 인공수정이 끝난 여왕벌은 마취에서 깨어나서 정상적인 행동을 할 때까지 설탕물과 화분단자를 넣은 상자속에 보관한다.

4. 여왕벌의 인공수정 확인

  Baer and Schmid-Hempel (2000)과 Yoon et al. (2006)의 방법에 의해 인공 수정된 여왕호박벌(B. ignitus)을 25℃에 1일간 보관하였다. 보관 1일 후 여왕벌을 해부하여 난소를 적출한 다음, 수정낭을 분리하였다(그림 34 A와 B). 분리된 수정낭에서 정액을 채취하여 400배 현미경하에서 관찰한 결과 정자가 살아있음을 확인을 하였다(그림 35 와 36). 또한 여왕벌의 수정낭을 전자현미경로 촬영한 결과(그림 37), 수정낭 속에 정자가 들어 있는 것이 확인되어 수정이 제대로 이루진 것을 알 수 있었다(그림 38). 이 개발된 인공수정기로 수정을 했을 경우, 숙련정도에 따라서 차이는 있었으나 평균 수정률이 91%로 확인되었다(표 1). 뒤영벌의 인공수정률은 숙련의 정도에 따라 충분히 더 높아질 것으로 예상된다.